Expresión plasmídica heteróloga en embriones ovinos obtenidos por fertilización in vitro usando el espermatozoide como vector

Patricio Díaz Pumará, Paula Rafaelli, Mercedes Nuñez, Gabriel Iorio, Mónica Vazquez-Levin, Juan Rosales, Mercedes Menarini, Carlos Obligado, Martín Brutti, Julia Aguerre

Resumen


Los resultados en la obtención de animales de granja genéticamente modificados (AGGM), no están aún a la altura de las expectativas científicas. A nivel mundial, los AGGM patentados y funcionales son muy escasos. Esta lentitud en resultados medido en términos de AGGM nacidos, reproductivamente viables por ensayo, es asignada al bajo rendimiento de las técnicas utilizadas, su costo elevado y el riesgo asociado a la bioseguridad. La hipótesis de trabajo fue que el espermatozoide fértil e intacto, de vertebrados mamíferos superiores, es capaz de portar ADN heterólogo y durante el acto de la fecundación, sea in-vitro o in-vivo, integrarlo funcionalmente al genoma del cigoto. Consecuentemente, será posible su expresión en los blastómeros del embrión y las células diferenciadas del organismo adulto. Asimismo, se postuló que los resultados medidos en términos de tasa de ensayo/éxito de esta técnica superan ampliamente a las otras técnicas utilizadas. Se lograron generar embriones ovinos por fecundación in-vitro (FIV) de acuerdo a los parámetros del tratamiento del espermatozoide (SPZ) previamente establecidos. Para lograr este objetivo se utilizaron 48 complejos cumulus ovocito (CCOs) provenientes de 35 tractos genitales ovinos de matadero, cultivados y madurados in-vitro. Dos muestras, una tratada con semen tratado y la otra (control) con semen no tratado, fueron puestas a fertilizar. Luego de la fertilización y cultivo los embriones fueron retirados y observados bajo microscopia microcaptura láser fluorescente (LCM) y con focal de fluorescencia. Si bien la muestra control debió ser descartada al momento de la observación por excesiva fibrinosis, en la muestra tratada pudieron observarse 11 blastocistos expandidos con intensa señal de fluorescencia en todas las blastómeros, 6 ovocitos no fertilizadosy 4 embriones malformados que no presentaron señal bajo luz fluorescente. Se consideró testigo a los ovocitos no fertilizados que no presentaron fluorescencia alguna; y se los estimó como evidencia válida para demostrar la transfección realizada por parte del SPZ. Solo aquellos que fueron fecundados, y en este caso la totalidad (100%), evidenciaron fluorescencia en todas las blastómeros en las diferentes muestras.

Palabras clave


animales de granja genéticamente modificados (AGGM); fecundación in-vitro (FIV); espermatozoide (FIV); complejo cúmulus ophorus (FIV); transferencia de genes mediada por espermatozoides (SMGT)

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