Expresión plasmídica heteróloga en embriones ovinos obtenidos por FIV usando el espermatozoide como vector - Diaz Pumara, Patricio Zenón; Rafaelli, Paula Mariana (Anuario de Investigación USAL, 2014)
La obtención de “animales genéticamente modificados” (AGM) tiene gran importancia a nivel nacional e internacional. Existen centenares de AGM, mayormente de laboratorio, utilizados como “modelo animal” para estudiar enfermedades humanas de difícil resolución como obesidad,Azheimer, diabetes, cáncer, artritis o Parkinson (Smolenski et al. & Wilmut et al., 2007). En animales de granja los resultados están lejos de las expectativas científicas de dos décadas atrás por los bajos rendimientos y altos costos de los métodos utilizados para modificar el genoma animal (Rifkin et al., 1998 & Wilmut et al., 2007) La técnica de “Transferencia de Genes Mediada por Espermatozoides” (“Sperm Mediated Gene Transfer”) es vista como la alternativa mas eficiente y económica si bien no se encuentra del todo establecida para muchas especies (Lavitrano et al, 1999; Lavitrano et al. 1996 & Pereyra-Bon 2011).Nuestro objetivo es demostrar que es posible la obtención de embriones ovinos genéticamente modificados mediante combinación de las técnicas de Fertilización In-Vitro (FIV) y Transferenciade Genes por Medio de Espermatozoides (SMGT) (Díaz Pumará et al., 2010; Rafaelli, et al., 2011; Pereyra-Bonnet et al., 2011& Webster et al., 2005). Utilizaremos como transgen el plásmido comercial pEGFP-N1 (GenBank Accession #U55762 Clontech USA) integrado al espermatozoide.Esta construcción plasmídica comercial presenta, precedida por el “casette” de iniciación Kozak, que le permite codificar eficientemente en células eukariotas, una zona de múltiple clonado (MCS) bajo el promotor del Citomegalovirus (CMV) humano a la que sigue un área que codifica genes para la producción de una señal fluorescente (GFP). Su utilización nos permitirá evaluar el resultado del método aplicado, observando los embriones producidos con Microscopia Confocal de Fluorescencia (Díaz Pumará et al., 2010; Rafaelli, et al., 2011; Pereyra-Bonnet et al., 2011& Webster et al., 2005).Más adelante nos proponemos lograr fetos y animales nacidos viables, genéticamente modificadoscon dos estrategias. En primer lugar la siembra de embriones transgénicos obtenidos por FIV y SMGT, luego la aplicación de inseminación artificial de hembras sincronizadas con semen co-incubado previamente con la construcción génica. La evaluación de estas dos estrategias se hará con controles de expresión de genes en las diferentes etapas del desarrollo 1) embrionario 2) fetal y 3) adulto utilizando los métodos disponibles, Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR, Hibridación Fluorescente In-Situ (FISH) y Western Blot (Lavitrano et al, 1999; Smolenski et al. 2007 & Webster et al., 2005).